Συσκευή ηλεκτροφόρησης DNA για σχολικά εργαστήρια

Πολλές φορές έχουμε σκεφτεί να υλοποιήσουμε κάποια εργαστηριακή δραστηριότητα χρησιμοποιώντας τεχνικές μοριακής βιολογίας, αλλά συνήθως το πρόβλημα είναι η έλλειψη υλικών και συσκευών. Και αυτό κυρίως οφείλεται πως όλα τα παραπάνω είναι αρκετά ακριβά υλικά. Παρακάτω θα περιγράψω την κατασκευή και τη δημιουργία μίας απλής συσκευής ηλεκτροφόρησης, όπου μπορούμε σε τάξεις Λυκείου ή Γυμνασίου να τη χρησιμοποιήσουμε για δείγματα DNA. Η συσκευή κατασκευάζεται και λειτουργεί χρησιμοποιώντας μόνο ασφαλή υλικά οικιακής χρήσης που μπορούμε εύκολα να τα προμηθευτούμε από καταστήματα για κατοικίδια ζώα, φαρμακεία ή σούπερ μάρκετ.

Για ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης το gel (πηκτή) απλώνεται και η ηλεκτροφόρηση τρέχει οριζόντια καθώς η πηκτή βρίσκεται βυθιμισμένη σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα. Ο εργαστηριακός εξοπλισμός διαθέτει ηλεκτρόδια από λευκόχρυσο τοποθετημένα κατά μήκος του πυθμένα σε κάθε άκρο της συσκευής ηλεκτροφόρησης και η πηκτή εναποτίθεται πάνω σε μία πλατφόρμα που χωρίζει δύο θαλάμους με ρυθμιστικά διαλύματα. Θα μπορούσε κάποιος να κατασκευάσει ένα Plexiglas, αλλά τα οικιακά πλαστικά δοχεία είναι εξίσου καλά. Το μέγεθός τους θα πρέπει να είναι κατάλληλο ώστε να χωρέσει την πηκτή, πλατύ ώστε η πηκτή να μην αγγίζει τις πλευρές και μακρύ ώστε η άνοδος να μπορεί να τοποθετηθεί τουλάχιστον 2 εκατοστά από την άκρη της πηκτής. Δεν υπάρχει λόγος προστατευτικού καλύμματος ή ηλεκτρικής θωράκισης, καθώς το ηλεκτρικό ρεύμα που θα εφαρμοστεί είναι χαμηλή έντασης άρα και ασφαλές στο άγγιγμα. Τα κουτιά πηκτής είναι απλές κατασκευές που θα πρέπει να φτιάχνονται εκ νέου για κάθε ηλεκτροφορητικό τρέξιμο.

Υπάρχουν αρκετά κατάλληλα υλικά για την κατασκευή ηλεκτροδίων. Σύρμα πλατίνας είναι ακριβό και δύσκολο να βρεθεί, ενώ σύρμα από ανοξείδωτο χάλυβα δεν είναι εύκολο να βρεθεί. Γυμνά καλώδια χαλκού (18 gauge), χαλύβδινο σύρμα (σύρμα δεματοποίησης ή συνδετήρες) μπορεί να χρησιμοποιηθούν. Ωστόσο αυτά διαβρώνονται γρήγορα και συχνά σπάνε κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Έτσι επιλέγεται αλουμινόχαρτο που διπλώνεται αρκετές φορές ώστε να δημιουργήσει μία λωρίδα ηλεκτροδίου, ~ 1 εκατοστού πλάτους. Αν και υπάρχει σημαντική διάβρωση και καταστροφή των ηλεκτροδίων αλουμινόχαρτου κατά την ηλεκτροφόρηση, όμως μπορούν να παραμείνουν άθικτα για τα συνήθη τρεξίματα. Θα πρέπει να είμαστε προσεκτικοί ώστε να τοποθετήσουμε την άνοδο τουλάχιστον 2 εκατοστά μακρύτερα από το άκρο της πηκτής, καθώς προϊόντα οξείδωσης μπορεί να συσσωρευτούν ως λευκό κροκυδώδες υλικό κοντά στην άνοδο προκαλώντας διάβρωση ή διάσπαση της πηκτής κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης.

Το τροφοδοτικό είναι συνήθως το πιο ακριβό αντικείμενο σε μία εργαστηριακή ηλεκτροφόρηση και απαιτεί υψηλό δείκτη ασφάλειας η χρήση του. Μία σειρά από 9V μπαταρίες είναι το τροφοδοτικό για την σχολική συσκευή ηλεκτροφόρησης. Πέντε μπαταρίες με απόδοση 45V παρέχουν ρεύμα χαμηλής και ασφαλούς έντασης. Οι μπαταρίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για δύο ή τρία ηλεκτροφορητικά τρεξίματα, 1 έως 1.5 ώρες, πριν αποφορτιστούν. Σε μεγάλες τάξεις με διάφορες ομάδες κατασκευής κουτιών πηκτής, οι μπαταρίες είναι πιθανόν να αποτελούν το υψηλότερο κόστος της δραστηριότητας. Εναλλακτικά μπορεί κάποιος να χρησιμοποιήσει ένα μετασχηματιστή, όπως ένα φορτιστή κινητού τηλεφώνου, μετά την αφαίρεση του βύσματος σύνδεσης εκθέτοντας τα καλώδια εξόδου χαμηλής τάσης, αλλά υπάρχει μεγαλύτερος κίνδυνος ηλεκτροπληξίας. Τα καλώδια που συνδέσουν την τροφοδοσία με τα ηλεκτρόδια αλουμινόχαρτου διαθέτουν κροκοδειλάκια, ώστε να είναι εύκολη η σύνδεση.

Σε μία εργαστηριακή ηλεκτροφόρηση DNA, χρησιμοποιείται αγαρόζη η οποία είναι καθαρή μορφή του άγαρ που αποτελείται μόνο από ουδέτερες αλυσίδες υδατανθράκων. Η χρήση άγαρ αντί αγαρόζης, έχει το μειονέκτημα πως οι φορτισμένοι υδατάνθρακες θα μπορούσαν να προκαλέσουν διάχυση στις μπάντες λόγω ήλεκτρο – όσμωσης, αλλά κατά τη χρήση της εν λόγω επιλογής δεν φάνηκε να προκαλείται σοβαρό πρόβλημα (άγαρ διαθέτουν τα περισσότερα εργαστήρια για την παρασκευή καλλιέργειας μικροοργανισμών – εναλλακτικά μπορούμε να αγοράσουμε από το εμπόριο). Οι πηκτές που χρησιμοποιούνται αποτελούνται από 1% ή 2 % άγαρ (w/v), που έχει λιώσει προσεκτικά σε φούρνο μικροκυμάτων πριν από τη χρήση του. Η πηκτή που θα χρησιμοποιηθεί μπορεί να πάρει το μέγεθος που θέλουμε χυτεύοντάς την ουσιαστικά σε κάποιο πλαστικό δοχείο. Εναλλακτικά μπορούμε να κατασκευάσουμε ένα μικρό ξύλινο παραλληλόγραμμο (ίσως από μολύβια ή παιδικά ξυλάκια) και να αδειάσουμε εκεί το περιεχόμενο της πηκτής περιμένοντας να στερεοποιηθεί. Συνήθως κατασκευάζουμε πηκτές στο μέγεθος μίας μικρής κάρτας δώρου (~54 × 85 χιλιοστά).

Τα πηγαδάκια για να φορτωθούν τα δείγματα DNA, δημιουργούνται στην πηκτή χρησιμοποιώντας μια χτένα. Με κλιπς η χτένα τοποθετείται κατακόρυφα ακριβώς πάνω από την επιφάνεια του δίσκου χύτευσης. Τα πηγαδάκια πρέπει να είναι όσο το δυνατόν βαθύτερα, αλλά αρκετά χιλιοστά της πηκτής πρέπει να παραμείνουν κάτω από τα δόντια της χτένας για να σχηματίσουν τον πυθμένα του πηγαδιού. Όταν η πηκτή πήξει, μπορεί να την αφαιρέσουμε από την κατασκευή χύτευσης με μια σπάτουλα προσθέτοντας κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα ώστε να ξεκολλήσει ευκολότερα.

Στα συστήματα ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα τόσο για την παρασκευή της πηκτής όσο και για το τρέξιμο της ηλεκτροφόρησης. Είναι σημαντικό να ρυθμιστεί το ρΗ ώστε το DNA να μην αποικοδομείται από την υψηλή ή χαμηλή τιμή ρΗ, ενώ ένας ηλεκτρολύτης (άλας) είναι απαραίτητος για τη μεταφορά του ρεύματος. Στα ερευνητικά εργαστήρια χρησιμοποιείται εξειδικευμένο ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο δεν μπορεί να βρεθεί σε μαγαζιά ευρείας κατανάλωσης. Ένα ρυθμιστικό διάλυμα που μπορεί εύκολα να κατασκευάσουμε είναι με τη χρήση 2g ανά λίτρο μαγειρικής σόδας (διττανθρακικό νάτριο) με 0.05 g ανά λίτρο NaCl. Εναλλακτικά ρυθμιστικά υπάρχουν διαθέσιμα και έχουν δοκιμαστεί σε διάφορες εργαστηριακές σχολικές ηλεκτροφορήσεις.

Η εξέλιξη της ηλεκτροφόρησης διαπιστώνεται παρακολουθώντας μόρια χρωστικής να μεταναστεύουν μέσω της πηκτής. Χρωστικές τροφίμων είναι κατάλληλες και μπορούν να προστεθούν στα δείγματα DNA. Για να βυθίζονται τα δείγματα μέσα στα πηγαδάκια της πηκτής, είναι χρήσιμο να προστεθεί πυκνή γλυκερόλη (γλυκερίνη) ή σιρόπι καλαμποκιού. Το ιξώδες του δείγματος μπορεί να ρυθμιστεί για καλύτερη απόδοση ανάλογα με τη μέθοδο φόρτισης που επιλέγεται (σύριγγα, πιπέτα, σταγονόμετρο ή οδοντογλυφίδα).

Με το τέλος της ηλεκτροφόρησης, οι ζώνες DNA θα πρέπει να εμφανιστούν στην πηκτή με κατάλληλη χρώση. Ερευνητικά χρησιμοποιείται το βρωμιούχο αιθίδιο, επικίνδυνο χημικό λόγω υψηλής μεταλλαξιγένεσης και τερατογένεσης. Στο σχολικό εργαστήριο εναλλακτικά χρησιμοποιείται το μπλε του μεθυλενίου (υπάρχει σε εργαστήρια του Λυκείου), που είναι ασφαλές και μπορεί επιπλέον να αγοραστεί από καταστήματα ανεφοδιασμού κατοικίδιων ζώων ως διάλυμα 2,3% που αραιώνεται 3000x ή περισσότερο, με νερό. Έχουν δοκιμαστεί και άλλες χρωστικές. Τελικά οι χρωματισμένες ζώνες DNA εμφανίζονται με λευκό φως, είτε τοποθετώντας την πηκτή πάνω σε ένα κουτί φωτός (πηγή φωτός πίσω από αδιαφανές πλαστικό) ή μετά την τοποθέτηση της πηκτής σε μια διαφανή πλαστική σακούλα και κρατώντας της προς ένα φωτεινό παράθυρο.

Περισσότερες πληροφορίες, για την αξιολόγηση που μπορεί να οργανώσει κάποιος μετά τη δραστηριότητα, για άλλους τρόπους παρασκευής ρυθμιστικών διαλυμάτων και χρωστικών, για θέματα ασφάλειας καθώς και θέματα ακρίβειας κατά την κατασκευή του εξοπλισμού, μπορείτε να διαβάσετε την πλήρη δημοσίευση με τίτλο ‘Inexpensive and safe DNA gel electrophoresis using household materials‘ που παρουσιάζεται στην επιστημονική επιθεώρηση ‘Biochemistry and Molecular Biology‘ με συγγραφείς τους ‘S. Ens, A. B. Olson, C. Dudley, N. D. Ross III, A. A. Siddiqi, K. M. Umoh & M. A. Schneegurt‘ ή να ανακτήσετε άμεσα το σχετικό αρχείο .pdf. Η πρόσβαση στο άρθρο είναι δωρεάν.